Серологические методы

Серологические методы

Реакция непрямой гемолитической агглютинации (РНГА)

Реакция непрямой гемолитической агглютинации (РНГА) относится к серологическим методам исследования. Серология – наука об изучении различных свойств плазмы крови. Если точнее говорить, то серология изучает взаимодействие антител, находящихся в организме человека, с определёнными антигенами. В медицинской клинико-лабораторной диагностики серология является одним из разделов иммунологии.

Основными серологическими методами исследования являются различные реакции. Такие реакции, как правило, делятся на прямые и косвенные. В свою очередь прямые бывают двухкомпонентными – это агглютинация, гемолитическая агглютинация или реакция преципитации. А косвенные реакции в основном трехкомпонентные, к ним относятся реакции торможения гемолитической агглютинации и нейтрализации (микроорганизма и вируса).

Агглютинация представляет собой слипание и выпадения в осадок клеток, имеющих определенный антиген, который вступил во взаимодействие с таким же антигеном. Реакция преципитации помогает определить в организме или исследуемом материале неизвестный антиген путем добавления определенного антитела. В результате при положительном результате выпадает осадок в виде хлопьев.

Такие исследования проводят для определения инфекционного или бактериологического заболевания. К сожалению, такие методы не являются однозначными в диагностики данных групп заболеваний. Поэтому при постановке диагнозов следует учитывать анамнез пациента, клинические проявления заболевания, а также назначать дополнительные подтверждающие методы исследования.

Реакция непрямой гемолитической агглютинации (РНГА) – этот метод специфичен для определения инфекционных заболеваний, вызванных бактериями (например, сальмонеллезов или дизентерии), риккетсиями, простейшими или грибами. Также этот метод эффективен в отношении диагностирования сифилиса.

Принцип метода РНГА

При постановке реакции используются эритроциты (может использоваться латекс), которые имеют на своей стенке определенные антигены. К планшету с эритроцитами добавляется исследуемый материал. Если в нем имеются специфические антитела или белки определяемого возбудителя заболевания, то они вступают в связь с антигенами, слипаются и образуют видимый осадок.

Стандартный набор в основном содержит пустой планшет, эритроциты баранов, которые и имеют чувствительность к антигену выявляемого заболевания. Также в наборе присутствуют эритроциты, не имеющие антигенов. Контроли – положительный и отрицательный и стандартный реактив для разведения сывороток.

Самое главное в постановке реакции – это строгое соблюдение всех этапов. Для начала берут пустой планшет для РНГА, в лунки раскапываются последовательно заранее разведенные исследуемые образцы. В первую и последнюю лунки капают контроли. К сывороткам добавляют эритроциты со специфическими антигенами. Инкубируют планшет 2 часа.

Далее описывают визуальный результат. Он учитывается в крестах. Реакция считается верной только тогда, когда контроли прошли реакцию. Соответственно, в лунке с положительным контролем эритроциты располагаются по всему дну в виде хлопьев («зонтик»). В случае с отрицательным контролем на дне лунки выпадает маленькое четкое кольцо из эритроцитов («пуговка»).

Учет результатов

Результат учитывается по интенсивности осадка из эритроцитов в лунке.

  • «-» отрицательный результат, как отрицательный контрольный образец, в виде плотного кольца на дне без какой-либо зернистости.
  • «+» слабая интенсивность реакции, кольцо на дне в виде «пуговки», но при этом видны отдельные отложения эритроцитов. Результат описывается как «сомнительный». Обязательная пересдачи крови через 2 недели.
  • «++» средняя интенсивность прошедшей реакции. Образовавшееся кольцо на дне лунки достаточно широкое с просветом в центре. Результат трактуется как слабо положительный.
  • «+++» интенсивная реакция. В лунке эритроциты занимают всю поверхность, выпадают в виде «зонтиков». То есть с тонким кольцом по периферии. Результат оценивается как положительный.
  • «++++» резкая интенсивность реакции. Вся лунка равномерно заполнена зернистыми выпадениями эритроцитов, иногда может быть в виде «зонтика». Также результат считается положительным или резко положительным.

Реакция может быть ложноположительной при протекании в организме человека тяжелых аутоиммунных заболеваний. Поэтому, если при пересдаче анализа реакция дает перекрест и результат отчитывается как ложноположительный, незамедлительно нужно обратиться к врачу для выяснения причины данной реакции.

Иногда этот метод принимают для подтверждения другого метода диагностики, основанного также на связывании антиген-антитело, называемого иммуноферментный анализ.

Подготовка к анализу

Чтобы не допустить ложноположительных результатов, к анализу нужно подготовиться заранее. Забор крови на данный анализ производится строго натощак и без употребления утром какой-либо жидкости. Нужно воздержаться от курения, хотя бы за час до сдачи анализа. Алкогольные напитки стоит исключить из рациона как минимум за сутки до анализа. Кровь на РНГА забирается из вены.

В настоящее время реакцию непрямой (пассивной) гемолитической агглютинации очень широко используют в медицинской лабораторной диагностике. Эта методика впервые была протестирована еще в 1965 году. И до сегодняшнего дня очень востребована. Она дает возможность не только определить, протекает ли в данный момент инфекционное заболевание у человека, но и на какой стадии оно находится.

Используют РНГА чаще всего для скрининга населения на наличие инфекционных заболеваний и для подтверждения положительных результатов, например, на сифилис. Основано это на том, что тест считается достаточно чувствительным и эффективным. Но при этом реакция проста в постановке и не требует много времени, результат можно получить уже в день сдачи крови.

Cергеева Екатерина Андреевна

Серологическое исследование крови

Что такое серологическое исследование крови?

Объект серологии — антигены и антитела

Серологическое исследование (СИ) основано на способности антигенов и антител связываться друг с другом. СИ позволяет с точностью выявить наличие у пациента определённого вируса либо бактерии, группу крови и резус, реактивность организма к антибиотикам, аутоиммунные заболевания, гормональные нарушения, индивидуальную специфичность белков, определить эффективность терапии.

Система иммунитета борется с проникающими в организм болезнетворными микробами (антигенами) при помощи антител, при этом создавая к каждому из вирусов, паразитов либо бактерий свой определённый тип защиты.

Антиген и антитело подходят друг другу как замочная скважина и ключ, при встрече они непременно связываются. Эта серологическая реакция позволяет выявлять различные виды антител либо антигенов.

Способность иммунитета вырабатывать особые вещества, нейтрализующие вредоносные частицы, была известна учёным давно. Но увидеть реакцию антиген-антитело в лабораторных условиях удалось только в конце XIX века. Было обнаружено, что в результате образования связки, комплексы выпадают в осадок, образуя хлопья либо помутнение. Такие реакции получили названия агглютинации и преципитации. В XX веке серология — наука о свойствах сыворотки, стремительно развивалась, обнаруживались новые методы диагностирования на основе реакций антиген-антитело. На сегодняшний день существует множество способов выявления иммунных комплексов, а СИ являются незаменимым звеном в диагностике, лечении, создании новых медицинских препаратов и вакцин.

Показания к проведению анализа.

Серологические исследования широко применяется в акушерстве

Серологические исследования сопровождают современного человека на протяжении всей жизни. Первые анализы на выявление определённых антител проводятся, когда малыш находится ещё в утробе. Беременная женщина сдаёт кровь на различные СИ для определения возможного резус-конфликта либо инфекций, способных навредить вынашиваемому плоду. Когда ребёнок появляется на свет, его ожидают серологические исследования, позволяющие диагностировать врождённые заболевания. Впоследствии анализы сдаются по следующим причинам:

  • вирусные, бактериальные, паразитарные инфекции;
  • выявление активности, стадии развития болезни;
  • гормональные патологии;
  • бесплодие;
  • аутоиммунные заболевания;
  • нарушение обмена веществ;
  • аллергии;
  • онкологические заболевания;
  • планирование беременности, период вынашивания, патологии беременных;
  • выявление ревматоидного фактора;
  • определение группы крови и резус-фактора;
  • эффективность терапии при различных болезнях;
  • эффективность вакцинации;
  • предоперационный и постоперационный период при необходимости оценки уровня некоторых антител;
  • изучение иммунного состояния организма.

Подготовка к исследованию.

Прием препаратов желательно отменить накануне теста

Так как серологические исследования охватывают широкий спектр анализов, в каждом конкретном случае может понадобиться определённая подготовка, но существуют общие правила сдачи серологического теста:

  • За сутки до исследования следует ограничить в рационе жирное и жареное, исключить алкоголь.
  • Последний приём пищи должен завершиться за 10 — 12 часов до анализа.
  • В день сдачи крови не следует употреблять кофе, чай либо иные напитки. Можно в небольшом количестве пить чистую воду.
  • Лекарственные средства перед анализом исключаются. Если приём отменить невозможно, необходимо предоставить врачу полный перечень препаратов, в том числе витаминов, пероральных контрацептивов.
  • Все другие исследования либо медицинские манипуляции проводятся после СИ.
  • Курение рекомендуется прекратить за 12 часов до взятия образца крови.
  • В предыдущий день следует избегать физических и эмоциональных нагрузок, а перед исследованием желательно 15 минут посидеть в полном покое.
  • СИ назначаются на утреннее время и сдаются натощак.

Методы проведения серологического исследования.

В серологии может применяться большое число методов

Все методики определения комплексов антиген-антитело (Аг-Ат) основываются на использовании известного Аг либо Ат в поиске неизвестного. Если необходимо обнаружить Аг, необходимы диагностические иммунные сыворотки с содержанием специфических Ат. Если целью СИ является выявление Ат, используются диагностикумы — взвеси, содержащие определённые Аг.

Серологические анализы могут отражать качественный либо количественный результат. При качественном исследовании итог может быть отрицательный или положительный, то есть искомый элемент либо обнаружен, либо нет. Количественный итог выражается в виде числового значения либо знаками «+» (обычно от одного до четырёх).

Непрямая гемагглютинация — один из методов диагностики

Методы серологических исследований:

  • Агглютинация. Связывание Ат с Аг с последующим формированием хлопьев либо осадка. Применяются прямые, непрямые, развёрнутые, ориентировочные реакции, позволяющие выявить антитела в сыворотке.
  • Гемагглютинация. Используются эритроциты с адсорбированными на них Аг либо Ат, которые склеиваются с соответствующими Ат и Аг. Образуемые комплексы выпадают в виде фестонного осадка.
  • Преципитация. Образование комплекса Аг-Ат с последующим осаждением в виде помутнения, именуемого преципитатом.
  • Коагглютинация. Выявление Аг при помощи Ат, адсорбированных на белке клеток стафилококка.
  • Торможение гемагглютинации. Ат иммунной сыворотки подавляют вирусные Аг, в итоге вирусы теряют способность склеиваться с эритроцитами.
  • Непрямая реакция Кумбса. Определяются Ат к поверхностным Аг эритроцитов.
  • Кольцепреципитация. Проводится на основе иммунной сыворотки с наслоением растворимого Аг.
  • Двойная радиальная иммунодиффузия. Реакция основана на диффундировании компонентов антисыворотки и Аг в лунках агара либо агарозы.
  • Реакция связывания комплемента. Связь Аг и Ат сопровождается адсорбцией комплемента, в качестве индикатора используются эритроциты барана и Ат к ним в составе гемолитической сыворотки.
  • Нейтрализация. Основана на нейтрализации вирусного агента антителами.
  • Реакции, основанные на маркировании Ат и Аг флуоресцентным либо ферментным составом — иммунофлюорисцентный (РИФ) и иммуноферментный (ИФА) методы.

Иммунофлюорисцентный метод.

«Свечение» в темнопольном микроскопе

Данный метод основан на использовании Ат, меченных флуоресцентным веществом. Чаще всего в качестве метки используется флуоресцеинизотиоционат, обладающий зелёным свечением в лучах ультрафиолета. Результат анализа оценивается по степени яркости свечения. Может быть использован ручной метод определения при помощи люминесцентного микроскопа, оптического микроскопа с люминесцентной насадкой, а также автоматический способ с применением микрочипового цитомера, проточного цитомера либо роботизированного флуоресцентного микроскопа.

РИФ проводится прямым и непрямым методом. Прямой способ означает непосредственное связывание сорбированного Аг с меченым Ат. Непрямой метод подразумевает использование немаркированных Ат для связки с Аг, а затем добавление меченых Ат, что позволяет избежать неспецифических реакций.

Иммуноферментный анализ.

Иммуноферментный анализ как метод серологической диагностики

ИФА основан на выявлении комплексов Аг-Ат при помощи маркирования одного из компонентов. В качестве метки используются различные ферменты, которые в результате ферментативной реакции образуют окрашивание. Существуют разнообразные методы ИФА, их можно классифицировать как гомогенные и гетерогенные методы.

Гомогенные означают, что все этапы реакции происходят в растворе.

Гетерогенные методы включают разделение на фазы с использованием твёрдого носителя.

Гомогенно-гетерогенные способы основываются на том, что комплексы Аг-Ат формируются в растворе, а затем для разделения используется твёрдая фаза.

Принцип «сэндвич»-метода

Существует множество вариаций методов ИФА, некоторые из них представлены ниже.

  1. Сэндвич-метод. К иммобилизованным Ат добавляется раствор с Аг, после образования комплексов носитель отмывают от лишних компонентов и добавляют маркированные Ат. В результате, Аг оказываются зажатыми иммобилизованными и мечеными Ат, откуда и произошло название метода.
  2. Неконкурентный непрямой ИФА. К иммобилизованным Аг присоединяют исследуемую сыворотку с Ат. Когда образуются комплексы, лишние Ат смывают и добавляют маркированные Ат, способные связаться с прикреплёнными к поверхностям лунок иммунными комплексами.
  3. Конкурентный прямой ИФА. К иммобилизованным Аг вносят исследуемую сыворотку и конъюгат, содержащий маркированные Ат. Формируются комплексы Аг-Ат нескольких видов: с мечеными Ат и с немаркированными Ат, которые вступают между собой в конкуренцию за связь с Аг.

Какие инфекции помогает выявить серологическое исследование.

Серологическая диагностика позволяет выявить возбудителя

СИ позволяют выявить определённое заболевание при наличии на него подозрения, то есть в основе анализа лежит знание того, какой именно элемент необходимо искать.

Если у пациента присутствует определённая симптоматика либо иные исследования указывают на заболевание, назначается серологический анализ.

Серологические исследования используют для диагностики следующих инфекций:

Серологические исследования способны выявить любые инфекции в лабораторных условиях, если в наличии есть Аг возбудителя инфекции.

Преимущества серологического метода исследования в диагностике инфекций.

Серологическая диагностика — быстро и доступно

  1. Высокая чувствительность и специфичность.
  2. Широкий спектр определяемых инфекций.
  3. Ранняя диагностика инфицирования.
  4. Возможность мониторинга развития заболевания.
  5. Быстрота и удобство в исполнении.
  6. Возможность использования минимального объёма исследуемого материала.
  7. Безопасность исследования.

Слаб RNGA

На все монеты, медали и монетовидные жетоны, переданные в Русское Нумизматическое Грейдинговое Агентство предоставляется финансовая гарантия.

В процессе проведения экспертизы, помимо установления подлинности и степени сохранности, производится оценка стоимости предмета для расчета гарантийного возмещения. Итоги оценки направляются заказчику для последующего согласования. Оценка осуществляется профессиональными оценщиками ООО «ПАРАДИГМА» (группа компаний «Русское Наследие»), имеющими членство в СРО и сдавшими квалификационный экзамен по направлению «Движимое имущество» в соответствии с ФЗ «Об оценочной деятельности». По необходимости могут быть привлечены независимые специалисты из других оценочных компаний.

В случае недостижения согласия заказчика с оценкой предмета в предоставлении услуги может быть отказано.

Согласованная стоимость предмета в целях определения размера гарантийного возмещения указывается в Акте оказанных услуг, подписываемом сторонами. Помимо этого, размер гарантийного возмещения указывается в открытом доступе в карточке предмета, находящейся в соответствующем разделе базы данных РНГА.

Владелец предмета в случае возникновения сомнений в его подлинности и в пределах срока действия гарантии приносит предмет в офис РНГА и передает его вместе с заполненной претензией на повторную экспертизу. В претензии, помимо прочего, указываются причины, по которым у заказчика возникло сомнение в подлинности предмета.

Претензия принимается только в случае, если:
— Предмет находится в оригинальном слабе РНГА;
— Слаб не содержит признаков вскрытия, не поврежден каким-либо иным способом;
— Индивидуальный номер слаба содержится в базе данных РНГА;
— Данные о предмете полностью совпадают с данными Акта приема-передачи, расположенными как в открытом доступе в соответствующем разделе базы данных РНГА, так и в закрытом разделе, доступном только для сотрудников РНГА.

В случае, если в течение срока действия финансовой гарантии внешний вид предмета изменился (появление и/или изменение патины и т.п.), то владелец предмета должен сообщить об этом в РНГА и предоставить предмет для внесения изменений в карточку предмета в базе данных РНГА. В случае, если владелец не предоставит такую информацию, то финансовая гарантия на предмет с изменившимися характеристиками не распространяется.

Претензии принимаются от владельца предмета, независимо от того, являлся ли он заказчиком услуг и с кем был заключен договор на слабирование.

После получения претензии предмет в присутствии заказчика извлекается из слаба и упаковывается в непрозрачный пластиковый пакет и опечатывается. В таком виде предмет передается на повторную экспертизу. Стороны подписывают Акт приема-передачи предмета на повторную экспертизу, с указанием того, что слаб был вскрыт представителем РНГА, а предмет упакован и опечатан с указанием номера пломбы.

РНГА самостоятельно выбирает экспертную организацию/экспертов, аккредитованных в РНГА. Список экспертных организаций/экспертов указан на сайте РНГА. По необходимости РНГА может обратиться в несколько экспертных учреждений по собственному выбору.

Расходы на проведение экспертизы распределяются следующим образом:
— при признании подлинности оплачивает владелец предмета;
— при признании подделки оплачивает РНГА.
Владелец предмета до передачи предмета на экспертизу вносит депозит в РНГА, равный стоимости проведения экспертизы. Указанная сумма возвращается владельцу предмета в течение 3 (трех) дней с момента получения заключения в случае, если предмет по результатам экспертизы будет признан подделкой.

По итогам экспертизы осуществляются следующие действия:
— если предмет признан подлинным, он возвращается владельцу предмета с соответствующим экспертным заключением;
— если предмет признан подделкой, РНГА выплачивает сумму гарантийного возмещения владельцу предмета при условии передачи предмета в РНГА.

Размер гарантийного возмещения рассчитывается исходя из стоимости, указанной в Акте оказанных услуг. Размер гарантийного возмещения составляет 50 % от согласованной стоимости предмета.

Узнать о размере гарантийного возмещения в отношении конкретного предмета можно .

Выплата гарантийного возмещения осуществляется в течение 30 (тридцати) календарных дней с момента получения экспертного заключения. Оплата по выбору владельца предмета осуществляется наличным денежными средствами либо путем перечисления денежных средств на счет владельца предмета. В последнем случае владелец предмета предоставляет в РНГА заявление о перечислении денежных средств на банковские реквизиты.

Выплата гарантийного возмещения осуществляется исключительно в адрес владельца предмета. Оплата на счета третьих лиц не допускается.

Выплата гарантийного возмещения осуществляется за счет собственных средств РНГА.

Гетерогенный ИФА объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения (однако первый этап имеет решающее значение). Если на первой стадии антиген или антитело используют в иммобилизованном состоянии и формирование специфического иммунокомплекса проходит на твердой фазе, то метод относится к твердофазным.

Гетерогенный твердофазный ИФА (ELISA = enzyme linked immunosorbent assay) получил наибольшее распространение в медицинской и лабораторной практике. Для его осуществления обычно применяют 96-луночные полистирольные планшеты, так как на полистироле можно легко адсорбировать антитела, а с помощью специальной обработки и различные антигены.

В случае применения ИФА для поиска антигена (рис. 8) диагностическую систему строят по принципу «сэндвича» (двухцентровый ИФА). Это означает, что для захвата искомого антигена и его детекции используют различные антитела к разным неинтерферирующим детерминантам.

Рисунок 8. Схема твердофазного ИФА для определения антигена

Первые (захватывающие) антитела сорбируют на стенках лунок. Исследуемый материал вносят в лунку, при этом антиген, взаимодействуя с антителами, фиксируется в ней. Лунки тщательно промывают буферным раствором, чтобы удалить не адсорбировавшиеся вещества. Затем вносят вторые (детектирующие) антитела против искомого антигена, меченные ферментом. В качестве фермента-метки обычно используют пероксидазу хрена. После инкубации лунку снова промывают, чтобы удалить несвязавшиеся меченые антитела. На заключительном этапе в лунки вносят хромогенный субстрат (например, орто-фенилендиамин или тетраметилбензидин). Ферментативное расщепление субстрата приводит к образованию окрашенных продуктов реакции.

Таким образом, изменение окраски содержимого лунки будет свидетельствовать о положительном результате реакции. Более того, интенсивность окрашивания характеризует количество антигена (антител) в образце. Измерение окрашивания раствора обычно проводят на ИФА-ридере (планшетном фотометре).

При серодиагностике (рис. 9) используются полистирольные планшеты, на стенках которых заранее с помощью тех или иных методов адсорбируется («нагружается») антиген. Для предотвращения неспецифического связывания антител с полистиролом оставшаяся свободной поверхность полистирола блокируется (белки молока, бычий сывороточный альбумин).

Рисунок 9. Схема твердофазного ИФА для определения антител

Исследуемая сыворотка вносится в лунку планшета. При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к сорбированному антигену. Не прикрепившиеся антитела удаляют промыванием. Затем в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченные ферментом (используя антитела против иммуноглобулинов различных классов, можно получить ценную информацию о характере иммунного ответа). Если в исследуемой сыворотке присутствовали искомые антитела, то они на данном этапе выступят в роли антигенов, с которыми прореагируют меченые антитела. Добавление после промывки хромогенного субстрата позволит учесть реакцию по развивающемуся окрашиванию в лунках.

Конкурентный твердофазный ИФА низкомолекулярных антигенов может быть реализован по следующей схеме (рис. 10). К иммобилизованным на носителе антителам добавляют материал, содержащий анализируемый антиген и определенное количество антигена, меченного ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.

Рисунок 10. Схема конкурентного твердофазного ИФА для определения антигена


Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *